Получение плазмид. Генная инженерия
Получение рекомбинантной ДНК в искусственных условиях и клонирование генов впервые было осуществлено в 1972 г. американскими учёными Бойером и Коэном.
В этой молекулярной конструкции ДНК плазмиды выполняет векторную (направляющую) функцию, поскольку плазмиды могут рекомбинироваться в хромосомной ДНК. Эта векторная конструкция в силу наличия в ней гена устойчивости к антибиотикам была введена в бесплазмидную, т. е. неустойчивую к антибиотикам бактериальную клетку . Бактерии с рекомбинантными плазмидами в силу того, что они имеют ген устойчивости к антибиотикам, в отличие от бесплазмидных бактерий, не погибают в питательной среде , содержащей антибиотик. Поэтому в опытную пробирку вводится антибиотик и выделяется клон рекомбинантной бактерии, который затем выращивается. В каждой бактерии, составляющей данный клон, будет содержаться отрезок чужой (гетерологичной) ДНК, и этот отрезок может размножаться по мере размножения бактериальной биомассы . Кроме того, если реком-бинантная плазмида обладает способностью к автономной репликации, то отрезок чужой ДНК может размножаться ещё десятки раз. Размножение чужой ДНК посредством векторной конструкции называется клонированием генов. В качестве вектора при клони-ровании отрезков ДНК могут быть использованы вирусные и фаговые молекулы ДНК или
Лекция№5 Генетическая инженерия.
Генная инженерия . Высшим достижением современной биотехнологии является генетическая трансформация, перенос чужеродных генов и других материальных носителей наследственности в клетки растений, животных и микроорганизмов, получение трансгенных организмов с новыми или усиленными свойствами и признаками.
По своим целям и возможностям в перспективе это направление является стратегическим. Оно позволяет решать коренные задачи селекции биологических объектов на устойчивость, высокую продуктивность и качество продукции при оздоровлении экологической обстановки во всех видах производств.
Важнейшим этапом для развития биотехнологии было выделение в середине текущего столетия молекулярной биологии в самостоятельную дисциплину. Возникновение молекулярной биологии стало возможным благодаря взаимодействию генетики, физики, химии, биологии, математики и др. Э. Чаргофф и З. Д. Хочкис, исследуя молекулярные соотношения нуклеотидных оснований в ДНК (аденин, гуанин, цитозин, тимин) показали, что у различных организмов они одинаковы. Это открытие сыграло ключевую роль в установлении структуры ДНК.
Большую роль в расшифровке структуры ДНК сыграл прогресс в области генетики бактерий и бактериофагов. Было установлено (А. Херши, М. Чейз, Дж. Ледерберг, Н. Циндер), что трансдукция (перенос генетического материала) может осуществляться с помощью бактериофага, а фаговой ДНК может принадлежать роль носителя наследственности. Б. Хейсом были выяснены также закономерности полового процесса у бактерий (конъюгация) , при котором из донорских клеток, имеющих F-фактор (фертильность), генетический материал переносится в реципиентные клетки. Дж. Уотсон и Ф. Крик предложили комплиментарную модель строения ДНК и механизм ее репликации; было раскрыто уникальное свойство ДНК – способность самовоспроизведения (репликация).
На базе молекулярной биологии и генетики микроорганизмов к началу 60-х гг. сформировалась молекулярная генетика. Г. Гамов в 1954 году выдвинул гипотезу о том, что каждый кодон (последовательность нуклеотидов, кодирующая одну аминокислоту) должен состоять из трех нуклеотидов. В 1961 году было подтверждено экспериментально, что первичная структура белка закодирована в ДНК в виде последовательности нуклеотидных триплетов (кодонов), каждая из которых соответствует одной из 20 аминокислот. К 1966 году удалось получить данные о строении генетического кода.
Было установлено, что последовательность триплетных кодонов, хранящаяся в ДНК, переписывается в недолговечные молекулы информационной РНК (иРНК). Данный этап ДНК иРНК был назван транскрипцией , а этап иРНК белок – трансляцией . Перенос аминокислоты и определение ее местонахождения в синтезирующейся белковой молекуле осуществляет транспортная РНК (тРНК) . На ДНК, как на матрице, синтезируется РНК, а на РНК – белок. У некоторых вирусов отсутствует первое звено, и РНК служит для них материалом наследственности.
Механизм контроля генной активности долгое время оставался неизвестным. Большое значение имели работы Ф. Жакоба и Ж. Моно, показавшие, что у бактерий есть
структурные гены , дающие информацию о синтезе определенных белков
регуляторные гены, которые осуществляют включение или выключение отдельных генов или их блоков.
Следующим важным шагом было проведение работ по расшифровке нуклеотидных последовательностей (секвенирование) , которое дает информацию о первичной структуре участка генома, выполняющего определенные функции. Структура и функции приобрели общее молекулярно-биологическое выражение, его суть заключается в том, что функциональные состояния выражают структурные изменения макромолекул и ассоциаций.
От изучения закономерностей функционирования генетического материала в клетке вскоре исследователи перешли к генетическим манипуляциям. Возникла новая экспериментальная технология, заключающаяся во введении в клетки чужеродных генов. Названия «генетическая (или генная) инженерия» или «работа с рекомбинантными ДНК» эквивалентны. Суть этой технологии заключается в воссоединении фрагментов ДНК in vitro с последующим введением новых («рекомбинантных») генетических структур в живую клетку.
В 1972 году Берг с сотрудниками создали первую рекомбинантную молекулу ДНК, состоящую из фрагмента ДНК вируса ОВ40 и бактериофага dvgal с галактозным опероном E. coli . Инструментом для генетического конструирования стали две группы ферментов – рестриктирующие эндонуклеазы (рестриктазы) и лигазы . Первые необходимы для получения однородных фрагментов ДНК, вторые – для их соединения. Рестриктазы и лигазы в совокупности с другими ферментами (нуклеазами, обратной транскриптазой, ДНК-полимеразой и др.) обеспечивают проведение всех генноинженерных манипуляций.
Генная инженерия - совокупность методов, позволяющих в пробирке переносить генетическую информацию из одного организма в другой. Перенос генов даёт возможность преодолевать межвидовые барьеры и передавать отдельные наследственные признаки одних организмов другим.
ЦЕЛЬ получение клеток, в промышленных масштабах нарабатывать некоторые белки.
1.Плазмиды.
Наиболее распространённым методом генной инженерии является метод получения рекомбинантных (содержащих чужеродный ген) плазмид, которые представляют собой кольцевые, двухцепочечные молекулы ДНК, состоящие из нескольких пар нуклеотидов. Каждая бактерия помимо основной, не покидающей клетку молекулы ДНК (5*10 6 пар нуклеотидов), может содержать несколько различных плазмид, которыми она обменивается с другими бактериями.
Плазмиды являются автономными генетическими элементами, реплицирующимися в бактериальной клетке не в то же время, что основная молекула ДНК. Плазмиды несут важные для бактерии гены, как гены лекарственной устойчивости. Разные плазмиды содержат разные гены устойчивости к антибактериальным препаратам.
Большая часть таких препаратов (антибиотиков) используется в качестве лекарств при лечении заболеваний человека и домашних животных. Бактерия, имеющая разные плазмиды, приобретает устойчивость к антибиотикам, солям тяжёлых металлов. При действии определённого антибиотика на бактериальные клетки плазмиды, придающие устойчивость к нему, быстро распространяются среди бактерий, сохраняя им жизнь.
Мощным элементом генной инженерии являются открытые в 1974 ферменты – рестрикционные эндонуклеазы, или рестриктазы (ограничение). Бактериальные клетки вырабатывают рестриктазы для разрушения инородной (фаговой) ДНК, что необходимо для ограничения вирусной инфекции. Рестриктазы узнают определённые последовательности нуклеотидов (сайты – участки узнавания) и вносят симметричные, расположенные наискось друг от друга разрывы в цепях ДНК на равных расстояниях от центра сайта. В результате на концах каждого фрагмента рестриктированной ДНК образуются короткие одноцепочечные «хвосты», которые называют липкими концами.
Методы генной инженерии.
Для получения рекомбинантной плазмиды ДНК одной из плазмид расщепляется выбранной рестриктазой. Ген, который нужно ввести в бактериальную клетку, расщепляют из ДНК хромосом человека с помощью рестриктазы, поэтому его «липкие» концы являются комплементарными нуклеотидным последовательностям на концах плазмид. Ферментом лигазой «склеивают» оба куска ДНК в результате получается рукомбинантная кольцевоя плазмида, которую вводят в бактерию E. coli. Все потомки этой бактерии (клоны) содержат в плазмидах чужеродный ген.
Что такое генетическая инженерия? Генетическая инженерия - это раздел молекулярной генетики, связанный с целенаправленным созданием новых комбинаций генетического материала. Основа прикладной генетической инженерии - теория гена. Созданный генетический материал способен размножаться в клетке-хозяине и синтезировать конечные продукты обмена.
Генная инженерия - направление исследований в молекулярной биологии и генетике, конечной целью которых является получение с помощью лабораторных приемов организмов с новыми, в том числе и не встречающимися в природе, комбинациями наследственных свойств.
В основе генной инженерии лежит обусловленная последними достижениями молекулярной биологии и генетики возможность целенаправленного манипулирования с фрагментами нуклеиновых кислот.
К этим достижениям следует отнести установление универсальности генетического кода, то есть факта, что у всех живых организмов включение одних и тех же аминокислот в белковую молекулу кодируются одними и теми же последовательностями нуклеотидов в цепи ДНК;
успехи генетической энзимологии, предоставившей в распоряжение исследователя набор ферментов, позволяющих получить в изолированном виде отдельные гены или фрагменты нуклеиновой кислоты, осуществлять in vitro синтез фрагментов нуклеиновых кислот, объединить в единое целое полученные фрагменты.
изменение наследственных свойств организма с помощью генной инженерии сводится к конструированию из различных фрагментов нового генетического материала, введение этого материала в рецепиентный организм, создания условий для его функционирования и стабильного наследования.
9384 0
Исследование молекул ДНК
За последние годы методы исследования ДНК получили колоссальное развитие. К самым совершенным методам, с помощью которых изучается ДНК, относятся методы создания молекул ДНК путем соединения последовательностей, имеющих совершенно различное происхождение. Получаемый продукт называют рекомбинантной ДНК.Рекомбинантная ДНК содержит ген (или гены) и вектор. Вектор - это фрагмент ДНК, обеспечивающий размножение гибридной ДНК и синтез конечных продуктов деятельности генетической системы - белков. Основные исследования выполнены на бактериях и вирусах, так как они являются одними из самых простых организмов, иначе их называют клетками «хозяина». Технология рекомбинантной ДНК позволяет получать генетические видоизмененные варианты целенаправленным и строго контролируемым путем.
Каким же образом гены высших организмов могут быть введены в бактериальные клетки? Наиболее распространенным методом генной инженерии является метод получения рекомбинантных ДНК, т. е. содержащих чужеродный ген, плазмид. Плазмиды представляют собой кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, состоящие из нескольких тысяч пар нуклеотидов. Каждая бактерия, помимо основной, не покидающей клетку молекулы ДНК (5106 пар нуклеотидов), может содержать несколько различных плазмид, которыми она обменивается с другими бактериями.
Плазмиды являются автономными генетическими, реплицирующими (т. е. размножающимися) в бактериальной клетке не в то же время, что основная молекула ДНК. Хотя на долю плазмид приходится лишь небольшая часть клеточной ДНК, именно они несут такие жизненно важные гены для бактерий, как гены лекарственной устойчивости. Разные плазмиды содержат различные гены устойчивости к антибактериальным препаратам. Простота устройства плазмид и легкость, с которой они «входят» и «выходят» из бактерий, используется генными инженерами для введения в клетки бактерий генов высших организмов.
Мощным инструментом генной инженерии являются открытые в 1974 г. ферменты - рестрикционные эндонуклеазы, или рестриктазы.
Рестрикция буквально означает «ограничение». Бактерии клетки вырабатывают рестриктазы для разрушения инородной (в первую очередь фаговой ДНК), что необходимо для ограничения вирусной инфекции. Рестриктазы «узнают» определенные последовательности нуклеотидов в ДНК (так называемые сайты - участки узнавания) и вносят симметричные разрывы в цепях ДНК на равных растояниях от центра сайта. В результате на концах каждого фрагмента рестриктированных ДНК образуются короткие одноцепочечные «хвосты», которые называются «липкими концами».
Из разных видов бактерий выделено около пятисот различных рестриктаз, для которых описаны сайты рестрикции.
Методы генной инженерии
Для получения рекомбинантной плазмиды ДНК одна из плазмид расщепляется выбранной рестриктазой. Гены, которые нужно ввести в бактериальную клетку, выщепляют из ДНК хромосом человека с помощью той же рестриктазы, поэтому его «липкие концы» являются комплементарными нуклеотидным последовательностям на концах плазмиды. Ферментом лигазой «сшивают» оба конца ДНК (гена и плазмиды), в результате получается рекомбинантная кольцевая плазмида, которую вводят в бактерию E. coli. Все потомки этой бактерии называются клоном и содержат в плазмидах чужеродный ген, способный вырабатывать белок, кодируемый этим геном.Весь процесс получения таких бактерий, называют клонированием. Он состоит из последовательных стадий (рис. 3.3):
1. Рестрикции - разрезания ДНК человека рестриктазой на множество различных фрагментов, но с одинаковыми «липкими» концами. Такие же концы получают при разрезании плазмидной ДНК той же рестриктазой.
Рис. 3.3. Введение гена в плазмиду Escherichia coli и клонирование этого гена в клетках кишечной палочки
Плазмида E.coli расщепляется рестрикционной эндонуклеазой в специфическом участке в обеих цепях ДНК, так что на концах расщепленной плазмиды располагаются короткие неспаренные последовательности дезоксирибонуклеотидов (ТТАА или ААТТ), т. е. по четыре нуклеотида, в которых основания представлены тимином и аденином.
Ген, который нужно встроить в плазмиду, выщепляют с помощью этой же рестриктазы, так что его концы являются комплементарными нуклеотидным последовательностям на концах плазмиды (ААТТ и ТТАА).
Обе ДНК (гена и плазмиды) сшивают вместе с помощью лигазы. Затем рекомбинантную плазмиду вводят в клетку Е.соН,которая, размножаясь, образует клон, все клетки которог содержат рекомбинантную плазмиду, а поэтому и чужеродный ген. Последний теперь клонирован в клетках кишечной палочки и индуцирует в ней синтез специфическогобелка.
2. Лигирования - включения фрагмента ДНК человека в плазмиды благодаря сшиванию «липких концов» ферментом лигазой.
3. Трансформации - введения рекомбинантных плазмид в бактериальные клетки, обработанные специальным образом - так, чтобы они на короткое время стали проницаемыми для макромолекул. Однако плаз-миды проникают лишь в часть обработанных бактерий. Их разделяют, используя определенную питательную среду (например, раствор антибиотика). Каждая из трансформированных бактерий размножается и образует колонию из многих тысяч потомков - клон.
4. Скрининга - отбора среди клонов трансформированных бактерий тех, которые сохраняют плазмиды, несущие ген человека.
Не всегда удается точно вырезать нужный ген с помощью рестриктаз. Многие гены расщепляются этими ферментами на несколько частей или не содержат последовательностей, узнаваемых рестриктазами. Поэтому в ряде случаев процесс клонирования начинают не с вырезания из хромосом случайных фрагментов ДНК, а с целенаправленного получения нужного гена.
Для этого из клеток человека выделяют и-РНК, которая является транскрипционной копией этого гена, и с помощью фермента - обратной транскриптазы (ревертазы) - синтезируют комплементарную цепь ДНК, после чего и-РНК, служащая матрицей при синтезе ДНК, уничтожается РНК-азой - специальным ферментом, способным гидролизовать цепь РНК. Оставшаяся цепь ДНК служит матрицей для синтеза обратной транскриптазой (ДНК-полимераза) комплементарной второй цепи ДНК.
Получаемая двойная спираль ДНК носит название к-ДНК (комплементарная ДНК), она соответствует гену, с которого была считана и-РНК. Такая к-ДНК встраивается в плазмиду, которая трансформирует бактерии, и получают клоны, содержащие только выбранные гены человека.
Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик
Владельцы патента RU 2422525:
Изобретение относится к генной инженерии, биохимии, биотехнологии и иммунологии. Описана рекомбинантная плазмида pESAT6-CBD, состоящая из искусственного бактериального оперона химерного белка, включающего промоторную область раннего промотора бактериофага Т5, ген химерного белка и терминатор транскрипции; бактериального оперона бета-лактамазы и бактериального участка инициации репликации типа ColE1. Изобретение также включает штамм Escherichia coli - продуценты химерного белка ESAT6-CBD, а также способ иммобилизации, концентрирования и очистки полученного белка на целлюлозе. Кроме того, изобретение относится к самому рекомбинантному белку ESAT6-CBD и иммуногенной композиции, содержащей его, направленной на индукцию иммунитета против туберкулезной инфекции. Изобретение позволяет получать штамм-продуцент, обеспечивающий высокий уровень продукции устойчивых иммуногенных белков, которые могут быть получены, иммобилизованы и очищены в одну стадию, а также получать эффективные иммуногенные композиции против туберкулеза. 6 н.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл.
Изобретение относится к генной инженерии, биохимии, биотехнологии и иммунологии.
В настоящее время единственной применяемой в мире вакциной против туберкулеза является БЦЖ (BCG, Bacillus Calmette-Guerin, 1921 г.), которая представляет собой живой аттенуированный штамм Mycobacterium bovis. Она безопасна, недорога и достаточно эффективно защищает детей как от заражения туберкулезом, так и от милиарного туберкулеза и туберкулезного менингита. Однако BCG не защищает взрослых от легочного туберкулеза, а именно эта форма болезни приводит к распространению инфекции и тяжелой эпидемической ситуации. Отсюда следует высокая актуальность разработки новых вакцин против туберкулеза.
Существует несколько направлений разработки новых противотуберкулезных вакцин, альтернативных БЦЖ: субъединичные вакцины, ДНК-вакцины и живые вакцины с улучшенными свойствами. Наиболее полно в экспериментальных моделях на животных охарактеризованы субъединичные вакцины, в том числе препараты, состоящие из нескольких секретируемых белков/пептидов Mycobacterium tuberculosis (Doherty Т.М., Olsen A.W., Weischenfeldt I J. et al. Comparative Analysis of Different Vaccine Constructs Expressing Defined Antigens from Mycobacterium tuberculosis. The Journal of Infectious Diseases, 2004, Vol.190, pp.2146-2153). Идентифицировано много антигенов М. tuberculosis, потенциально важных в качестве компонентов новых вакцин. К ним относятся, в частности, иммунодоминантные секретируемые антигены, присутствующие в культуральном фильтрате М. tuberculosis. Среди секретируемых антигенов М. tuberculosis лучше всего изучены антигены ESAT-6 (Early Secret Antigen Target-6), CFP-10 (culture-filtrate protein-10) и белки комплекса 85 (Ag85A, В, С).
Белки ESAT-6 и CFP-10 транслируются в составе одной рамки считывания, RD1, присутствующей в разных штаммах вирулентных микобактерий, но утраченной вакцинным штаммом BCG. Как нативные, так и рекомбинантные белки ESAT-6 и CFP-10 индуцируют синтез интерферона-гамма (ИФН-гамма, ИФН-γ) Т-лимфоцитами периферической крови инфицированных М. tuberculosis лиц (Johnson P.D., Stuart R.L., Grayson M.L. et al. Tuberculin-purified protein derivative-, MPT-64, and ESAT-6-stimulated gamma interferon responses in medical students before and after Mycobacterium bovis BCG vaccination and in patients with tuberculosis. Clin. Diagn. Lab. Immunol, 1999, Vol.6, No. 6, pp.934-937; Berthet F.X., Rasmussen P.В., Rosenkrands I. et al. Mycobacterium tuberculosis operon encoding ESAT-6 and a novel low-molecular-mass culture filtrate protein (CFP-10). Microbiology, 1998, Vol.144, No.11, pp.3195-3203), поэтому оба белка используются для разработки различных тестов серологической диагностики туберкулеза (Arend S.M., Andersen P., van Meijgaarden K.E. et al. Detection of active tuberculosis infection by Т cell responses to early-secreted antigenic target 6-kDa protein and culture filtrate protein 10. J. Infect. Dis., 2000, Vol.181, No. 5, pp.1850-1854; van Pinxteren L.A., Ravn P., Agger EM. et al. Diagnosis of tuberculosis based on the two specific antigens ESAT-6 and CFP10. Clin. Diagn. Lab. Immunol., 2000, Vol.7, No.2, pp.155-160).
Задачей изобретения является разработка вакцинного препарата на основе отдельных белковых компонентов с высоким уровнем экспрессии и стабильности этих белков в бактериальной системе, эффективная система очистки и простота тестирования иммуногенности.
Для решения этой задачи используется конструирование химерного белка за счет соединения в одной рамке трансляции двух генов - гена для вакцинирующего белка и гена для белка-носителя, что приводит к синтезу в бактериальной системе химерного белка. Был создан рекомбинантный белок, состоящий из двух компонентов: антигена М. tuberculosis и целлюлозосвязывающего домена CelD из термофильного микроорганизма Anaerocellum thermophilum (CBD). Рекомбинантный белок, имеющий в своем составе CBD, можно в одну стадию иммобилизовать на целлюлозном носителе. В результате происходит одновременная очистка, концентрирование и стабилизация, а также обеспечивается защита от протеаз бактерий-продуцентов. При этом исходные антигенные свойства функционально активного белкового домена не нарушаются.
При использовании этого подхода был получен двухкомпонентный рекомбинантный белок. Последовательность гена М. tuberculosis esat6 кодирует полноразмерный белок, который формирует первый белковый домен, определяющий функциональные иммунологические свойства комплексной молекулы. Далее следует соединяющая (спейсерная) аминокислотная последовательность из нескольких чередующихся остатков глицина и серина (Gly-Ser). Второй белковый домен кодируется последовательностью гена эндоглюконазы CelD A. thermophilum; он определяет способность продукта взаимодействовать с целлюлозным сорбентом. Белковые продукты нарабатываются в непатогенных лабораторных штаммах Escherichia coli. Иммобилизированный на целлюлозе антиген представляет собой суспензию сорбента с адсорбированным на нем белке. Целлюлозный носитель выступает в роли адъюванта при иммунизации, обеспечивающего укрупнение, полимеризацию антигена, без которого развивается более слабый иммунный ответ на белковый моноантиген. Антигены в свободном состоянии представляют собой растворы с определенной ионной силой, свободные от примесей липополисахаридов и ДНК штамма-продуцента.
Очистка конечных продуктов от высокотоксичных для организма липополисахаридов, балластных белков, ДНК и РНК штаммов-продуцентов является важной проблемой.
Таким образом, заявляемая группа изобретений позволяет создавать штамм Е. coli, обеспечивающий высокий уровень продукции рекомбинантного белка, содержащего белок М. tuberculosis ESAT6; получить простую и эффективную схему очистки рекомбинантного белка, специфически и эффективно индуцирующего иммунный ответ на антигены микобактерий, в том числе синтез ИФН-гамма, необходимый для противотуберкулезной защиты; создавать иммуногенную композицию на основе рекомбинантных белка на целлюлозном носителе (адъювант).
Указанный результат достигается за счет синтеза рекомбинантного белка ESAT6-CBD в клетках рекомбинантного штамма Е. coli M15 , несущего рекомбинантную плазмиду pESAT6-CBD. Также за счет создания комплексного препарата ESAT6-CBD-целлюлоза, в котором рекомбинантный белок рекомбинантный белок ESAT6-CBD (концентрация 2,1 мг/мл) иммобилизован на целлюлозе (по массе 2,8% в препарате) и ресуспендирован в 1x PBS буфере рН 7,2-7,4.
Сущность изобретения состоит в том, что включенная в заявку плазмида содержит следующие существенные для функционирования структурные элементы:
а) искусственный бактериальный оперон химерных белков, состоящий из:
Промоторной области раннего промотора бактериофага Т5 (7-87 п.н.), обеспечивающий эффективную транскрипцию мРНК;
Рекомбинантный ген, кодирующий химерный белок «последовательность белка ESAT6 М. tuberculosis - спейсер - целлюлозосвязывающий домен А. thermophilum» - ESAT6-CBD (117-1007 п.н.);
Нетранслируемую область терминации транскрипции бактериального оперона, обеспечивающую эффективное окончание транскрипции pESAT6-CBD (1041-1147 п.н.);
б) бактериальный оперон bla, кодирующий белок бета-лактамазу, селективный маркер для трансформации штамма Е. coli pESAT6-CBD (3217-4067 п.н.) комплементарной цепи.
в) бактериальный участок инициации репликации типа ColE1, обеспечивающий репликацию плазмиды в штамме Е. coli pESAT6-CBD (2474-2485 п.н.).
Таким образом, создана рекомбинантная плазмида pESAT6-CBD (4282 п.н.), кодирующая бифункциональный рекомбинантный белок ESAT6-CBD, обладающий способностью самопроизвольно связываться с целлюлозосодержащим сорбентом. Плазмида содержит следующие структурные элементы: искусственный бактериальный оперон химерного белка, включающий промоторную область раннего промотора бактериофага Т5 (80 п.н.), ген химерного белка ESAT6-CBD (890 п.н.) и терминатор транскрипции (94 п.н.); бактериальный оперон бета-лактамазы (860 п.н.) и бактериальный участок инициации репликации типа ColE1 (11 п.н.). Штамм-продуцент рекомбинантного белка ESAT6-CBD получают трансформацией клеток Е. coli штамма M15 плазмидой pESAT6-CBD. Штамм обеспечивает продукцию рекомбинантного белка ESAT6-CBD после проведения процедуры индукции (изопропил-β-D-тио-галактопиранозидом) (ИПТГ) до 12-15% от тотального белка клетки.
Штамм Е. coli M15 , несущий плазмиду pESAT6-CBD - продуцент бифункционального рекомбинантного белка ESAT6-CBD характеризуются следующими признаками.
Культурально-морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидные, неподвижные, грамотрицательные. При рассеве на чашке с 2,0% агаризованной средой LB рост в виде отдельных колоний, иногда в R-форме с неровными краями. Хорошо растет на плотных и жидких питательных средах (LB-бульон, LB-агар, МПА, МПБ).
Физиолого-биохимические признаки. Клетки растут при температуре от +4°С до +42°С, при оптимуме рН=6,8-7,5. Штамм разлагает глюкозу, маннит с образованием кислоты, не разлагают сахарозу, арабинозу, галактозу, сбраживают мальтозу, ксилозу, сорбит, рамнозу. Существенным при использовании данных штамма является чувствительность к налидиксовой кислоте (25 мг/мл), стрептомицину (20 мг/мл) и рифампицину (25 мг/мл). Проявляет устойчивость к ампициллину (до 300 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды pESAT6-CBD и к канамицину (до 50 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды pREP4.
По созданию комплексного препарата рекомбинантного белка и аморфной целлюлозы технический результат достигается за счет создания двухкомпонентного рекомбинантного белка, состоящего из белка ESAT6 М. tuberculosis и гена эндоглюконазы CelD A. thermophilum. А также за счет получения комплексного препарата (иммунологической композиции), в которой рекомбинантный белок (Ag-CBD), иммоблизован на аморфной целлюлозе (Ag-CBD-целлюлоза).
Рекомбинантный белок ESAT6-CBD имеет в своем составе домен, определяющий его способность связываться с целлюлозой, что позволяет проводить в одну стадию концентрирование, очистку и иммобилизацию белкового продукта на целлюлозе. Иммобилизация на целлюлозе обеспечивается за счет присутствия в рекомбинантном белке целлюлозосвязывающего домена эндоглюконазы CelD из термофильного микроорганизма A. thermophilum, который обладает высоким сродством к кристаллической и аморфной целлюлозам и обеспечивает необратимое связывание с носителем в широком диапазоне значений рН=4-11, температуры: от 0 до +75°С и концентраций NaCl: от 0 до 5 М.
Поскольку в Е. coli отсутствуют белки, связывающиеся с целлюлозой, то синтезируемый в клетках Е. coli, трансформированных плазмидой pESAT6-CBD, рекомбинантный белок ESAT6-CBD является единственным белком штамма-продуцента, прочно связывающимся с целлюлозой. Это обеспечивает возможность одностадийного получения высокоочищенного препарата белка, иммобилизованного на сорбенте. На чертеже приведена схема плазмиды pESAT6-CBD.
Была исследована иммуногенность комплексного препарата ESAT6-CBD - целлюлоза на мышах двумя методами. Во-первых, мышей иммунизировали в подушечки задних лап и через 18 дней сравнивали пролиферативный ответ Т-клеток с ответом мышей, которых иммунизировали только CBD-целлюлоза. Был выявлен выраженный специфический иммунный ответ на все три антигена, с индексами пролиферации опыт: контроль = 5-7. В другой схеме мышей иммунизировали под кожу спины 2-кратно с 2-недельным интервалом иммуногенным и контрольным препаратом. Через 5 недель был исследован пролиферативный ответ Т-клеток и количество Т-клеток, продуцирующих ИФН-гамма. Был выявлен 2-3-кратный прирост ИФН-гамма-положительных Т-клеток и 4-6-кратное усиление пролиферации в присутствии соответствующих антигенов в культуре клеток по сравнению с контрольными животными.
Для проверки протективной активности исследуемых препаратов иммунные к антигену ESAT-6 (иммунизация препаратом ESAT-6-CBD-целлюлоза), а также контрольные животные (иммунизация CBD-целлюлоза и физиологический раствор) были заражены внутривенно вирулентным штаммом М. tuberculosis H37Rv в дозе 5×10 6 КОЕ/мышь. Через 3 недели после заражения по 4 мыши из каждой группы были забиты и гомогенаты органов были посеяны на чашки Петри с агаром Дюбо. В легких и селезенках мышей, иммунных к ESAT-6, наблюдалось 7-кратное уменьшение бактериальной нагрузки по сравнению с контрольными животными.
Техническим результатом, достигаемым при осуществлении изобретения, является получение штамма-продуцента, обеспечивающего высокий уровень продукции устойчивого иммуногенного белка, который может быть получен, иммобилизован и очищен в одну стадию. Получена эффективная иммуногенная композиция против туберкулеза.
Изобретение проиллюстрировано следующими примерами, приведенными ниже. Генно-инженерные и микробиологические манипуляции, амплификацию и секвенирование ДНК проводили по стандартным методикам (Т.Parish, N.G.Stoker. Mycobacterium tuberculosis protocols., Humana Press Inc., 2001, Methods in molecular Medicine, 54; Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование, М.: Мир, 1984; Клонирование ДНК. Методы. Под ред. Д.Гловера, Пер. с англ., Москва, Мир, 1988; Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S. et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 1988, Vol.239, No. 4839, pp.487-491; Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNAsequencing with chain-terminating inhibitors (DNA polymerase/nucleotide sequences/bacteriophage 4Х174). Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1977, Vol.74, No.12, pp.5463-5467).
Пример 1. Получение плазмиды.
а) Получение фрагмента гена белка М. tuberculosis с последующим их клонированием.
Фрагмент гена белка ESAT-6 получали методом ПЦР. В качестве матрицы для амплификации использовали хромосомную ДНК М. tuberculosis. Для синтеза целевого фрагмента гена был сконструированы специфические праймеры (ЗАО «Синтол», РФ), в последовательность которых для клонирования были введены сайты эндонуклеаз рестрикции BamHI, BspMII (Kpn2I) и NcoI (полужирный, подчеркнутый), а также кодоны инициации и терминации трансляции (курсив).
В рабочую смесь для ПЦР добавляли по 2,5 мМ каждого праймера, реакцию проводили при следующих условиях: а) 95°С 10 мин; б) 94°С 4,5 мин, 60°С 5 мин, 72°С 40 с; в) 94°С 2 мин, 65°С 1 мин, 72°С 40 с, 94°С 1 мин - 30 циклов; г) 65°С 5 мин; д) 72°С 10 мин; е) 10°С - хранение. Для клонирования двуцепочечных фрагментов ДНК, плазмидный вектор pQE6 гидролизовали эндонуклеазами рестрикции NcoI и Kpn2I при 37°С в буфере, содержащем 33 мМ Трис-ацетата (рН 7,9 при 37°С), 10 мМ ацетата магния, 66 мМ ацетата калия и 0,1 мг/мл BSA в течение 1 ч. В 1,2% агарозном геле проводили разделение продуктов рестрикции. Выделенный из агарозного геля фрагмент вектора pQE6 (размером 3016 п.н.) объединяли с фрагментами cfp10 (293 п.н.), esat6 (305 п.н.). Лигировали при 25°С в буфере, содержащем 40 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl 2 , 10 мМ DTT, 0,5 мМ АТФ (рН 7,8 при 37°С) с помощью ДНК лигазы бактериофага Т4 в течение 1 ч. Продукты реакции переосаждали при -20°С 96% C 2 H 5 OH с добавлением ацетата аммония в течение 1,5 ч. После переосаждения смесь растворяли в деионизированной воде (mQ H 2 O). Методом электропорации полученными лигазными смесями трансформировали компетентные клетки Е. coli штамма M15 (Nal S , Str S , rif S , lac - , ara - , gal - , mtl - , F - , recA + , uvr +). После трансформации клоны отбирали на агаризованной среде LB, содержащей антибиотики ампициллин (50 мг/мл) и канамицин (25 мг/мл). Плазмидную ДНК из колоний выделяли методом щелочного лизиса; анализировали методом рестрикционного картирования эндонуклеазами рестрикции BglI, BglII, BspMII, NcoI. Отбирали клоны плазмидной ДНК pESAT6 (3309 п.н.), содержащие в своем составе последовательность туберкулезного белка. Первичную структуру полученных конструкций подтверждали секвенированием.
б) Получение плазмиды, содержащей последовательность гена микобактериального белка, Gly-Ser спейсера и целлюлозосвязывающего домена CBD.
Для получения конструкции, кодирующей последовательность гена белка М. tuberculosis ESAT6, Gly-Ser спейсера, и целлюлозосвязывающего домена CBD, плазмиду pESAT6 гидролизовали эндонуклеазами рестрикции BglII, PvuI, XbaI при 37°С в буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 10 мМ хлорида магния, 100 мМ хлорида натрия и 0,1 мг/мл BSA, в течение 1 часа. Плазмиду pspCBD (ptt10), кодирующую последовательность Gly-Ser и целлюлозосвязывающего домена, гидролизовали эндонуклеазами рестрикции BamHI и BglI при 37°С в буфере, содержащем 66 мМ Трис-ацетата (рН 7,9 при 37°С), 20 мМ ацетата магния, 132 мМ ацетата калия и 0,2 мг/мл BSA в течение 1 часа. В 1,2% агарозном геле проводили разделение продуктов рестрикции. Выделенные из агарозного геля фрагменты рестрикции плазмидной ДНК pESAT6 (2696 п.н.) и pspCBD (2414 п.н.) лигировали с помощью ДНК-лигазы бактериофага Т4. Методом электропорации полученными лигазными смесями трансформировали компетентные клетки Е. coli M15 . После трансформации клоны отбирали на агаризованнной среде LB, содержащей антибиотики ампициллин и канамицин. Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса, анализировали методом рестрикционного картирования эндонуклеазами рестрикции BamHI, BglI, BgLII, NcoI, PvuI. Отбирали клоны плазмидной ДНК pESAT6-CBD (4282 п.н.), содержащей в своем составе последовательность туберкулезного белка, Gly-Ser спейсера, и целлюлозосвязывающего домена CBD. Первичную структуру полученных конструкций подтверждали секвенированием.
Пример 2. Конструирование штамма Е. coli - продуцента антигена М. tuberculosis, соединенного с целлюлозосвязывающим доменом.
Для получения штамма Е. coli - продуцента рекомбинантного белка ESAT6-CBD, клетки штамма E. coli M15 трансформировали плазмидой pESAT6-CBD. Трансформированные клетки выращивали в 3,5 мл среды LB с ампициллином и канамицином при 37°С до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 550 нм (около 2,5 ч). В культуру добавляли 3 мкл 0,1 М раствора изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ, IPTG) и выращивали в течение 3 ч. Для контроля продукции рекомбинантных белков в штаммах Е. coli M15 , Е. coli M15 применяли метод электрофореза по Лэммли в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН). Разделение белков проводили в 12% полиакриламидном геле (ПААГ) в стандартной системе буферов (электродный буфер: 25 мМ Tris-HCl, 192 мМ глицин, 0,1% додецилсульфат натрия, рН 8,3; буфер для геля: 375 мМ Трис-HCl, рН 8,8). По окончании электрофореза гели окрашивали 0,15% раствором Кумасси G250 в 25% изопропаноле и 10% уксусной кислоте и отмывали в 10% уксусной кислоте.
При сравнении спектра белков в штаммах Е. coli M15 и Е. coli M15 обнаруживали появление дополнительной белковой полосы. Молекулярная масса дополнительной полосы 32,0 кДа, соответствовала расчетной для белка ESAT6-CBD. Уровень синтеза белков в Е.coli определяли, сравнивая интенсивность окрашивания полосы рекомбинантного белка с полосой соответствующего белка-стандарта Unstained Protein Molecular Weight Marker («Fermentas», Литва).
Для проверки растворимости синтезируемого белка биомассу выращенного штамма (Е. coli M15 ) подвергали разрушению в 1% TES буфере (25 мМ Трис-HCl, 5 мМ ЭДТА, 50 мМ NaCl, 1% Тритон Х-100, 5 мг/мл лизоцим) в соотношение биомасса-буфер 1:2 и гомогенизировали до однородной массы. После центрифугирования пробы разделяли на 2 фракции: растворимых клеточных белков (над осад очная жидкость) и нерастворимых (осадок). Обе фракции подвергали разрушению в лизирующем буфере (0,05 М Трис-HCl, рН 6.8, 0,5% Triton X-100, 0,5 М NaCl, 0,25 М MgCl 2 , 5 мг/мл лизоцим, 10 мг/мл PMSF, 20 мг/мл ДНКаза) в соотношении 1:1; гомогенизировали до однородной массы; прогревали при +95°С 15 мин. Результаты контролировали с помощью электрофореза по Лэммли. Было показано, что рекомбинантный белок ESAT6-CBD синтезируется в клетках Е. coli как в растворимой фракции, так и виде телец-включений.
Пример 3. Получение рекомбинантного белка ESAT6-CBD в свободном состоянии и иммобилизованном на целлюлозе.
Для получения рекомбинантного белка культуру штамма Е. coli M15 выращивали в 1000 мл среды LB с ампициллином и канамицином при 37°С до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 550 нм. В среду добавляли 100 мкл 0,1 М раствора ИПТГ и выращивали в течение 3 ч. Клетки осаждали центрифугированием при 5500 об/мин в течение 15 мин.
Осадок ресуспендировали в лизирующем буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 0,25 мМ NaCl, 5 мМ MgCl 2 , 0,15 мМ PMSF, 0,1% Тритон-Х100, 0,5 мг/ мл лизоцима, 20 мг/мл ДНКазы; из расчета 1 г биомассы на 4 мл буфера. Дополнительно суспензию обрабатывали ультразвуком 3 раза по 20 с. После центрифугирования при 16000 об/мин в течение 30 мин фракция нерастворимых клеточных белков оставалась в осадке, растворимых - в надосадочной жидкости.
Осадок (нерастворимая фракция) суспендировали в лизирующем буфере (50 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 10 мМ ЭДТА, 0,002 объема β-меркаптанола) и добавляли равный (по массе) объем мочевины. После перемешивания выдерживали на водяной бане при +37°С до полного растворения мочевины. Центрифугировали при 12000 об/мин 30 мин и отбирали надосадочную жидкость. Для очистки рекомбинантного белка надосадочную жидкость переносили на колонку с микрокристаллической целлюлозой (Perloza MT-200, «lontosorb», Czech Republic). Элюцию белков с целлюлозы проводили раствором 8-2 М мочевины и 50 мМ Трис-HCl (рН 8,0). Для удаления мочевины образцы диализовали против PBS буфера при 25°С в течение ночи.
Растворимую фракцию белков использовали для иммобилизации на инъекционной (аморфной) целлюлозе. К надосадочной жидкости добавляли 1/3 объема 30% суспензии целлюлозы и буфер, содержащий 0,5% Тритона Х-100, 0,5 М NaCl; инкубировали при 25°С 1 ч. Центрифугировали в течение 10 мин при 8000 об/мин, осадок ресуспендировали в том же буфере; отмывку целлюлозы повторили 2 раза. Осадок ресуспендировали в PBS буфере. В иммобилизованном на сорбенте состоянии белки представляют собой суспензию.
Концентрацию белков в свободной и иммобилизованной форме определяли по Бредфорду при длине волны 595 нм. Для определения % содержания целлюлозы в пробах, где белки были иммобилизованы на сорбенте, образцы подвергали лиофилизации в течение двух дней с последующим пересчетом полученных масс. Таким образом, были получены следующие комплексные препараты (иммуногенные композиции) (Ag-CBD, Ag-CBD-целлюлоза), степень чистоты которых составила не менее 95%:
Пример 4. Способ проверки иммуногенности комплексных препаратов Ag-CBD-целлюлоза на мышах.
Самкам мышей инбредной линии мышей I/St, генетически чувствительных к туберкулезу (Nikonenko BV, Averbakh MM, Lavebratt С, Schurr E, Apt AS. Comparative analysis of mycobacterial infections in susceptible I/St and resistant A/Sn inbred mice. Tubercle Lung Dis, 2000, 80:15-25), вводили подкожно с двухнедельным интервалом следующие препараты: 1) ESAT-6-CBD-целлюлоза (10 мкг на мышь по содержанию ESAT-6); 2) CBD-целлюлоза (10 мкг на мышь по содержанию CBD) - отрицательный контроль; 3) однократно вакцина BCG (10 6 КОЕ на мышь) - положительный контроль. Через 5 недель оценивали содержание в селезенках Т-лимфоцитов, продуцирующих ИФН-гамма в присутствии соответствующих антигенов в культуральной жидкости методом ELISPOT, с подсчетом клеток, реагирующих с антителами анти-ИФН-гамма, через 60 часов после начала культивирования. Результаты приведены в таблице:
Результаты показывают, что вакцинация моноантигенами, связанными с целлюлозой через CBD-домен, приводит к специфической активации продуцентов ИФН-гамма. Вакцинация теми же антигенами, в тех же количествах, но без адсорбции на целлюлозе, не вызывает иммунного ответа (данные не приводятся).
Пример 5. Способ проверки защитного эффекта против туберкулеза комплексных препаратов Ag-CBD-целлюлоза на мышах.
Мышей инбредной линии C57BL/6 вакцинировали препаратом ESAT-6-CBD-целлюлоза (10 мкг на мышь по содержанию ESAT-6); CBD-целлюлоза (10 мкг на мышь по содержанию CBD - отрицательный контроль; 1) физиологическим раствором (отрицательный контроль 2) дважды, подкожно, с интервалом 2 недели. Через 5 недель после второй вакцинации мышей заражали внутривенно в дозе 5×10 6 КОЕ вирулентного штамма М. tuberculosis H37Rv. Через 4 недели после заражения из каждой группы забивали по 4 мыши и проводили оценку размножения микобактерий в легких и селезенке методом посева гомогенатов органов на агар Дюбо с последующим подсчетом колоний. Оставшиеся мыши (8 в каждой группе) наблюдались для определения кривых выживания. Результаты приведены на фиг.3. Установлено, что вакцинация специфическими антигенами на целлюлозном сорбенте достоверно снижает число микобактерий в органах (Фиг.3А, Р<0,01, непарный тест Стьюдента) и продлевает срок жизни зараженных животных (Фиг.3Б, Р<0,01, критерий Гохана для кривых выживания).
Оценка параметров иммунного ответа у мышей:
Пролиферативная активность Т-лимфоцитов CD4 + в тестах in vitro;
Увеличение в результате иммунизации количества клеток иммунной системы, продуцирующих ИФН-гамма;
Снижение количества вирулентных микобактерий в легких и селезенке зараженных мышей;
Увеличение сроков выживания мышей после заражения.
1. Рекомбинантная плазмида pESAT6-CBD, представленная нуклеотидной последовательностью №1, обеспечивающая экспрессию рекомбинантного белка ESAT6-CBD, состоящего из полноразмерного белка ESAT6 M.tuberculosis, Gly-Ser спейсера, целлюлозосвязывающего домена гена эндоглюканазы CelD из A.thermophilum, размером 4282 п.н., состоящая из следующих структурных элементов:
искусственный бактериальный оперон рекомбинантного белка ESAT6-CBD, включающий: промоторную область раннего промотора бактериофага Т5 (7-87 п.н.), ген рекомбинантного белка ESAT6-CBD (117-1007 п.н.), нетранслируемую область терминации транскрипции (1047-1141 п.н.);
бактериальный оперон бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину (3217-4067 п.н.);
бактериальный участок инициации репликации типа ColEl (2474-2485 п.н.), обеспечивающий репликацию плазмиды в штаммах E.coli.
2. Рекомбинантный штамм E.coli M15 , полученный трансформацией штамма E.coli M15 плазмидой по п.1, продуцент белка ESAT6-CBD.
3. Способ получения, иммобилизации, концентрирования и очистки рекомбинантного белка ESAT6-CBD на целлюлозе, включающий:
выращивание клеток штамма E.coli Ml5 no п.2;
иммобилизацию белка ESAT6-CBD в составе клеточных экстрактов штамма E.coli M15 на целлюлозном сорбенте за счет аффинного взаимодействия при процедуре инкубации с последующей отмывкой от несвязавшихся бактериальных белков, при этом происходит концентрирование целевого продукта и его очистка; выделение целевого продукта.
4. Рекомбинантный белок ESAT6-CBD с молекулярной массой 32,0 кДа (pI 5,05), включающий полноразмерный белок ESAT6 с последовательностью №2, Gly-Ser спейсер с последовательностью №3, целлюлозосвязывающий домен гена эндоглюканазы CelD из A.thermophilum с последовательностью №4.
5. Иммуногенная композиция, содержащая белок по п.4 ESAT6-CBD, иммобилизованный на целлюлозе, в эффективном количестве, специфически активирующая Т-лимфоциты, синтезирующие ИФН-гамма при стимуляции антигенами микобактерий.
6. Способ проверки протективных свойств иммуногенной композиции по п.5 в отношении туберкулезной инфекции в модели туберкулеза у мышей, включающий
а) вакцинацию мышей инбредной линии C57BL/6 дважды, подкожно, с интервалом 2 недели препаратами: иммуногенная композиция по п.5 из расчета 10 мкг на мышь по содержанию действующего вещества; CBD-целлюлоза из расчета 10 мкг на мышь по содержанию CBD - отрицательный контроль 1; физиологическим раствором - отрицательный контроль 2;
в) заражение через 5 нед. после второй вакцинации мышей внутривенно в дозе 5·10 6 КОЕ вирулентным штаммом M.tuberculosis H37Rv;
c) умерщвление через 4 нед. после заражения из каждой группы по 4 мыши и проведение оценки размножения микобактерий в легких и селезенке методом посева гомогенатов органов на агар Дюбо с последующим подсчетом колоний;
d) построение кривых выживания при проведении наблюдений за оставшимися мышами (8 в каждой группе), при этом о протективных свойствах иммуногенной композиции по п.5 судят по результатам стадий с) и d).
Похожие патенты:
Изобретение относится к биотехнологии и касается аллеля A SNP41 гена PDE4D, а также его применения в качестве диагностического маркера для оценки индивидуальной предрасположенности к инсульту в русской популяции.
Строение рекомбинантной ДНК. Гибридная ДНК имеет вид кольца. Онасодержит ген (или гены) и вектор. Вектор - это фрагмент ДНК, обеспечивающий размножение гибридной ДНК и синтез конечных продуктов деятельности генетической системы - белков. Большая часть векторов получена на основе фага лямбда, из плазмид, вирусов SV40, полиомы, дрожжей и др. бактерий.
Синтез белков происходит клетке-хозяине. Наиболее часто в качестве клетки-хозяина используют кишечную палочку, однако применяют и др. бактерии, дрожжи, животные или растительные клетки. Система вектор-хозяин не может быть произвольной: вектор подгоняется к клетке-хозяину. Выбор вектора зависит от видовой специфичности и целей исследования. Ключевое значение в конструировании гибридной ДНК несут два фермента. Первый - рестриктаза - рассекает молекулу ДНК на фрагменты по строго определенным местам. И второй - ДНК-лигазы - сшивают фрагменты ДНК в единое целое. Только после выделениятаких ферментов создание искусственных генетических структур стало технически выполнимой задачей.
Этапы генного синтеза. Гены, подлежащие клонированию, могут быть получены в составе фрагментов путем механического или рестриктазного дробления тотальной ДНК. Но структурные гены, как правило, приходится либо синтезировать химико-биологическим путем, либо получать в виде ДНК-копии информационных РНК, соответствующих избранному гену. Структурные гены содержат только кодированную запись конечного продукта (белка, РНК), и полностью лишены регуляторных участков. И поэтому не способны функционировать в клетке-хозяине.
При получении рекДНК образуется чаще всего несколько структур, из которых только одна является нужной. Поэтому обязательный этап составляет селекция и молекулярное клонирование рекДНК, введенной путем трансформации в клетку-хозяина. Существует 3 пути селекции рекДНК: генетический, иммунохимический и гибризационный с мечеными ДНК и РНК.
Если геном какого-либо организма разрезать, вставить в плазмидные или вирусные вектора и ввести в клетку, то в таком виде его можно сохранить. При разрезании плазмидной или фаговой ДНК вероятность выпадения целых и неизмененных кусков генома довольно высока.
Такой способ получения геномной библиотеки получил название «метод дробовика», так как геном в данном случае представлен отдельными фрагментами.
Принципы создания плазмидных и вирусных векторов общие, поэтому рассмотрим их на примере плазмидных. Следует отметить, что из вирусных ДНК лучше использовать ДНК фагов, так как они имеют большую емкость и позволяют вставлять более крупные куски генома.
Очищенные кольцевые молекулы ДНК обрабатывают рестриктазой, получая линейную ДНК. Клеточную ДНК обрабатывают той же рестриктазой, добавляют к плазмидной, добавляют лигазы. Таким образом получают рекомбинантную плазмидную ДНК, которую вводят в бактериальные или дрожжевые клетки. Плазмида реплицируется с образованием многих копий. Многие плазмиды несут ген устойчивости к антибиотикам, и если в рекомбинантной плазмиде есть такой ген, то клетки легко выявлять, выращивая на среде с антибиотиком.
Каждая такая колония представляет собой клон или потомство одной клетки. Плазмиды одной колонии содержат клон геномной ДНК, а совокупность плазмид можно назвать библиотекой геномной ДНК. Недостаток такого метода в том, что фрагменты ДНК образуются в огромном количестве. Разрезание геномной ДНК определяется случаем, поэтому лишь часть фрагментов содержат полноценные гены. Некоторые фрагменты могут содержать только часть гена или же интронные последовательности.
Наиболее распространенным методом генной инженерии является метод получения рекомбинантных, т.е. содержащих чужеродный ген, плазмид. Плазмиды представляют собой кольцевые двухцепочные молекулы ДНК, состоящие из нескольких тысяч пар нуклеотидов. Этот процесс состоит из нескольких этапов.
1.Рестрикция - разрезание ДНК,например,человека на фрагменты.
2. Лигирование - фрагмент с нужным геном включают в плазмиды и сшивают их.
3. Трансформация - введение рекомбинантных плазмид в бактериальные клетки. Трансформированные бактерии при этом приобретают определенные свойства. Каждая из трансформированных бактерий размножается и образует колонию из многих тысяч потомков - клон
4. Скрининг - отбор среди клонов трансформированных бактерий тех, которые плазмиды, несущие нужный ген человека.
Весь этот процесс называется клонированием.
Предыдущие материалы:
|
